Ензими як бioкаталiзатори

Властивості ферментів як біологічних каталізаторів.

Фермент – від лат. fermentum – закваска; ензим – від греч. ен – усередині, зиме – закваска.

Ферменти, або ензими, – це є каталізатори білкової природи, що утворюються і функціонують у всіх живих організмах. Походження термінів пов'язане з тим, що спочатку ферментативні процеси були відкриті і вивчені в бродильному виробництві. У кожній клітці є сотні різних ферментів. З їх допомогою здійснюється багато хімічних реакцій, які можуть з великою швидкістю йти при температурах, відповідних для даного організму, тобто в межах від 5 до 40° С. Щоб ці реакції з тією ж швидкістю протікали поза організмом, було б потрібні високі температури і різкі зміни деяких інших факторів. Для клітки це означало б загибель, оскільки вся робота клітки будується так, щоб уникнути будь-яких скільки-небудь помітних змін в нормальних умовах її існування. Отже, ферменти можна визначити як біологічні каталізатори, тобто як речовини, прискорюючи реакції. Вони абсолютно необхідні, тому що без них реакції в клітках протікали б дуже повільно і не могли підтримувати життя. Сукупність біохімічних реакцій, що каталізуються ферментами, складає суть обміну речовин, що є відмінною рисою всіх живих організмів. Через ферментативний апарат, регуляція його активності відбувається і регуляція швидкості метаболічних реакцій, їх спрямованість.

Будучи каталізаторами, ферменти мають ряд загальних з небіологічними каталізаторами властивостей:
1. Ферменти не входять до складу кінцевих продуктів реакції і виходять з неї, як правило, в первинному вигляді, тобто вони не витрачаються в процесі каталізу (в даний час доведено, що деякі ферменти в кінці хімічної реакції піддаються модифікації і навіть розпаду, а не звільняються в незмінному вигляді, як постулював Л. Міхаеліс).
2. Ферменти не можуть порушити ті реакції, протікання яких суперечить законам термодинаміки, вони прискорюють тільки ті реакції, які можуть протікати і без них.
3. Ферменти не зміщують положення рівноваги, а лише прискорюють його досягнення.

Специфічні властивості:

1. Звичайно ж, по своїй хімічній будові всі ферменти є білками.

2. Ефективність ферментів набагато вища, ніж небіологічних каталізаторів (швидкість протікання реакції за участю ферменту вище на декілька порядків).

3. Ферменти володіють вузькою специфічністю, вибірковістю дії на субстрати, тобто на речовини, перетворення яких вони каталізують. Висока специфічність ферментів обумовлена конфірмаційною та електростатичною компліментарністю між молекулами субстрату і ферменту і унікальною структурою активного центру ферменту, що забезпечують "пізнавання", високу спорідненість і вибірковість протікання одній якій-небудь реакції з тисячі інших хімічних реакцій, що здійснюються одночасно в живих клітинах.

Залежно від механізму дії розрізняють ферменти з відносною (або груповою) специфічністю і абсолютною специфічністю. Так, для дії деяких гідролітичних ферментів найбільше значення має тип хімічного зв'язку в молекулі субстрату. Наприклад, пепсин розщеплює білки тваринного, і рослинного походження, хоча вони можуть істотно відрізнятися один від одного як по хімічній будові і амінокислотному складу, так і по фізико-хімічним властивостям. Проте пепсин не розщеплює вуглеводи або жири. Пояснюється це тим, що місцем дії пепсину є пептидний -CO-NH- зв'язок. Для дії ліпази, що каталізує гідроліз жирів на гліцерин та жирні кислоти, таким місцем є складноефірний зв'язок. Аналогічною відносною специфічністю володіють також деякі внутріклітинні ферменти, наприклад гексокіназа, що каталізує у присутності АТФ фосфорилування майже всіх гексоз, хоча одночасно в клітках є специфічні для кожної гексози ферменти, що виконують таке ж фосфорилування.

Абсолютною специфічністю дії називають здатність ферменту каталізувати перетворення тільки єдиного субстрату. Будь-які модифікації в структурі субстрату роблять його недоступними для дії ферменту.

Стереохімічна специфічність ферментів обумовлена існуванням оптично ізомерних L- і D-форм або геометричних (цис- і транс- ) ізомерів хімічних речовин. "Так, відомі оксідази L- і D-амінокислот, хоча в природних білках виявлені тільки L-амінокислоти. Кожен з видів оксідази діє тільки на свій специфічний стереоізомер. Наочним прикладом стереохімічної специфічності є бактерійна аспартатдекарбоксілаза, що каталізує відщеплювання СО2 тільки від L-аспаргинової кислоти з перетворенням її на L-аланин" [1].

4. Регулювання ферментів як біо-каталізаторів. "Через регуляцію ферментативного апарату здійснюється скоординованість всіх метаболічних процесів в часі і просторі, направлена на відтворення живої матерії, підтримку постійності внутріклітинного середовища, на пристосування до змінних зовнішніх умов" [2].

5. Термолабільність ферментів. Швидкість хімічних реакцій залежить від температури, реакції, що тому каталізують ферментами, також чутливі до змін температури. Проте унаслідок білкової природи ферменту теплова денатурація при підвищенні температури знижуватиме ефективну концентрацію ферменту з відповідним зниженням швидкості реакції. Таким чином, термолабільність, або чутливість до підвищення температури є однією з характерних властивостей ферментів, що різко відрізняють їх від неорганічних каталізаторів. При 100°С майже всі ферменти втрачають свою активність (виняток становлять, очевидно, тільки один фермент м'язової тканини – міокіназа, яка витримує нагрівання до 100 °С). При низьких температурах (0°С і нижче) ферменти, як правило, не руйнуються, хоча активність їх падає майже до нуля. У всіх випадках має значення час дії відповідної температури. В даний час для пепсину, трипсину і ряду інших ферментів доведено існування прямої залежності між швидкістю інактивації ферменту і ступенем денатурації білка. На термолабільність ферментів певний вплив має концентрація субстрату, рН середовища і інші чинники.

6. Залежність активності ферментів від рн середовища. Ферменти зазвичай найбільш активні в межах вузької зони концентрації водневих іонів, відповідної для тваринних тканин в основному виробленим в процесі еволюції фізіологічним значенням рН середовища 6.0 – 8.0 рН - оптимум дії ферментів лежить в межах фізіологічних значень. Виняток становить пепсин, рН - оптимум якого рівний 2.0. Пояснюється це тим, що пепсин входить до складу шлункового соку, що містить вільну соляну кислоту, яка створює оптимальне кисле середовище для дії цього ферменту. З іншого боку, рН – оптимум аргінази лежить в сильно лужній зоні (близько 10.0); такого середовища немає в клітках печінки, отже, in vivo аргіназа функціонує, мабуть, не в своїй оптимальній зоні рН середовища. Вплив змін рн середовища на молекули ферменту полягає в дії на стан і ступінь іонізації кислотних і основних груп (СООН - групи дикарбонових амінокислот, SH-групи цистеїну, імідазольного азоту гістидіна і ін.). При різних значеннях рН середовища активний центр може знаходитися в частково іонізованій або в неіонізованій формі, що позначається на третинній структурі білка і відповідному формуванні активного ферментно-субстратного комплексу. Крім того, має значення і стан іонізації субстратів і кофакторів.

Отримання ферментних препаратів.

Для отримання ферментних препаратів використовують як мікроскопічні гриби, так і бактерії і дріжджі. Іноді отримання технічного ферментного препарату кінчається проведенням процесу ферментації, наприклад, в спиртній промисловості для оцукрювання крохмалю використовують рідку культуру Aspergillus niger. Згодом її додають в рідкому вигляді в кількості 10 – 12 % до цукроварного затору. Проте активність ферментів в культуральній рідині швидко знижується. Тому широко практикують отримання сухих технічних ферментних препаратів.

Технічні препарати ферментів. Комплексний амілолітичний ферментний препарат отримують шляхом вирощування цвілевих грибів на твердому живильному середовищі з подальшою сушкою і подрібненням отриманої маси. Активніший препарат ферменту отримують шляхом екстракції такого "грибного солоду" з подальшим випаровуванням і сушкою. Ще активніші ферментні препарати можна виділити з культуральної рідини шляхом осадження амілази ацетоном і подальшим висушуванням коагулятом при температурі 27-27°С. Для осадження ферменту часто використовують і сульфат амонію. Заздалегідь культуральну рідину випаровують при температурі 40°С до 40%-ного змісту сухих речовин. Коагулят сушать разом з наповнювачем.

Комплекс ферментів протеолітичної і амілолітичної дії отримують за допомогою культури Bacillus subtilis. Це аероби, грампозитивні, рухомі палички. Для цих бактерій характерний дуже багатий комплекс гидролітичних ферментів. Як джерела живлення вони можуть використовувати білки, вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Bacillus subtilis культивують як методом поверхневого культивування на висівках, так і в рідких середовищах особливого складу по методу глибинного культивування.

Целюлолітичні ферментні препарати. Виробництво целюлаз ґрунтується на використанні культури гриба Trichoderma viride. Способи отримання целюлаз, що існують в даний час, в глибинній культурі припускає вирощування мікроорганізмів-продуцентів целюлаз на живильному середовищі, що містить як джерела вуглецю, як правило, очищену целюлозу, або ж що містять її природні субстрати. Але отримання целюлази з використанням як основний компонент середовища природної целюлози (наприклад, деревна тирса) зв'язане з поряд технологічних труднощів. Раціональніше використання живильного середовища, що містить розчинний "індуктор". Таким живильним середовищем може бути молочна сироватка, основним компонентом якої є лактоза (заздалегідь від молочної сироватки відокремлюють білок). Як продуцент може бути використаний гриб Trichoderma lignorum, що дозволяє отримати комплекс целюлолітичних ферментів, необхідний для розщеплювання природних субстратів, які містять целюлозу.